真菌ITS鉴定

本文关键词：真菌鉴定、菌种鉴定、真菌基因鉴定、分子鉴定、真菌ITS鉴定、微生物检测、微生物鉴定

技术介绍

ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。ITS：内转录间隔区，是位于真菌核糖体RNA（rRNA）基因转录区或对应多顺反子rRNA前体中大、小亚基rRNA之间的核酸序列。用于真菌鉴定的ITS序列通常包括ITS1、5.8S和ITS2。真菌ITS 区域长度一般在500～750bp(碱基对)。

基于ITS基因测序的优点

为了解决D2基因真菌鉴定的局限性，相关研究发现核糖体操纵子中的ITS序列可更好的被应用于真菌的系统鉴定。在真菌的核糖体操纵子中有两个ITS区域。ITS1位于18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。整个rRNA操纵子一起转录，但转录后的rRNA，两个不具备功能的ITS被剪切掉。ITS序列作为一个间隔序列十分重要，但同时它又不具备功能，因此，它的突变速度会大于5.8S、18S和28S基因。这少量的突变提升，使得ITS的序列相比D2具备更好的多态性。因此，将ITS1-5.8S-ITS2整个测序有助于真菌分类。

传统的真菌鉴定和其限制因素

真菌是一类特殊的真核微生物，大约有十万余种。在洁净室造成污染的真菌主要为霉菌和酵母两种。鉴定方法上，基于表型鉴定方法由于相对较低的成本，被大量实验室广泛地使用，但这往往需要有经验的技术人员才能胜任，比如对培养基、培养条件的选择等；此外表型鉴定还受到参考数据库的大小和类型的限制，这些数据库多是面向临床诊断而不是工业应用，所以基于这类数据库的鉴定结果往往存在一定的偏差。准确的鉴定结果对发现污染菌超标和溯源十分重要，错误的鉴定结果往往导致后续的消杀治理等工作并没有效果。近年来，分子生物学的发展，为真菌的准确鉴定提供了新的可靠的技术手段和鉴定渠道。

相比基于表型信息的鉴定结果，基因测序提供的数据具有更准确，重现性好的特点，这已被业界普遍认可和接受。美国食品和药物管理局（FDA）在2004年更新的指导文件中引入了遗传方法，在美国食品药品管理局“FDA无菌生产指南（FDA Guidance for Industry. Sterile Drug Products Produced by AsepticProcessing – Current Good Manufacturing Practice）”文件中，FDA强调在进行环境微生物监测方面，相比传统的生化和表型的技术，基因型的鉴定方法已经被证实具有更准确和更精确的优势，特别是在无菌测试、模拟灌装污染等的调查中具有重要的价值。cFDA于2015年12月1日开始实施的2015版药典中，在“9204 微生物鉴定指导原则”、“9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则”中也建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定，微生物菌群信息有助于预期常见菌群，同时也强化了通过测序进行基因型鉴定的概念。

相比与传统生理生化鉴定，分子型鉴定具有许多优势：

①可检测范围更广：即使无法通过培养得到纯菌落，只要能够提取得到微量的DNA就可以通过分子生物学的方法进行测序鉴定。

②鉴定结果重复性更好：DNA序列在通常情况下都是稳定的，不会应为菌群的生长周期而发生变化。因此，在菌群生长的任何时期进行基因型鉴定，得到的结果都是一致的。（即便是死菌，只要DNA未被降解也可以进行鉴定）。

③鉴定结果一致性高：序列比对通过特定的算法由计算机自动分析生成，不向传统生化鉴定方法一样需要人工对结果进行判读。

④鉴定结果数字化，方便存储和溯源调查：基因型鉴定得到的是碱基排布序列信息，在进行溯源调查或者室间比对时，可以通过直接比对序列相似度来判断两个样本是否为同一个菌种，并不依赖其在物种鉴定时所得到的种属信息。

⑤鉴定数据库鉴定范围更广：与传统生化方法相比，细菌基因型鉴定的数据库所收录的菌种数量更多（为生化鉴定数据库的5~10倍）。同时，随着研究的进一步深入，每年都有大量新的菌种基因信息被收录进数据库中。