细菌16S鉴定

本文关键词：细菌鉴定、菌种鉴定、细菌基因鉴定、分子鉴定、细菌16S鉴定、微生物检测、微生物鉴定

技术介绍：

细菌16S鉴定（16S ribosomal RNA gene identification）是指用通过对细菌16S rRNA基因进行测序和比对的方式进行目标细菌种属鉴定的方法，也是2020版《中国药典》推荐的细菌基因型鉴定方法。

在1965年，人们发现细菌的核糖体RNA具有保守性和可变性；1985年开始有人通过核糖体序列计算来分析物种进化关系；在2000年，伯杰氏系统细菌学手册正式引入基因序列（包括16S rRNA 基因等Marker基因）作为细菌分类标准。

16S rRNA 基因是所有的细菌都具有的基因，长度适中(在1500~1600bp)，进化上具有良好的时钟性质，结构与功能上具有高度的保守性，能很好体现不同菌属之间的差异，又能轻松利用测序技术得到其序列，故被细菌学家和分类学家普遍认可，素有“细菌化石”之称。

16S rRNA 基因序列由9个可变区和10个保守区（下图一）构成。

保守区序列反映了物种间的亲缘关系，可变区序列则能体现物种间的差异。通过在保守区设计引物，利用PCR反应扩增出高变区序列，然后通过一代测序技术得到高变区序列信息，再将其与数据库中已经存在的菌种对应区间的序列信息进行比对分析，来进行菌种鉴定。

一般情况下，在细菌的分类学中，普遍的共识是16S序列相似度在97%以上的，可以认为目标菌种与数据库序列来源菌种为同一个属；16S序列相似度在99%以上的，可以认为目标菌种与数据库序列序列来源菌种为同一个种。

相比基于表型信息的鉴定结果，基因测序提供的数据具有更准确，重现性好的特点，这已被业界普遍认可和接受。美国食品和药物管理局（FDA）在2004年更新的指导文件中引入了遗传方法，在美国食品药品管理局“FDA无菌生产指南（FDA Guidance for Industry. Sterile Drug Products Produced by AsepticProcessing – Current Good Manufacturing Practice）”文件中，FDA强调在进行环境微生物监测方面，相比传统的生化和表型的技术，基因型的鉴定方法已经被证实具有更准确和更精确的优势，特别是在无菌测试、模拟灌装污染等的调查中具有重要的价值。cFDA于2015年12月1日开始实施的2015版药典中，在“9204 微生物鉴定指导原则”、“9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则”中也建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定，微生物菌群信息有助于预期常见菌群，同时也强化了通过测序进行基因型鉴定的概念。

相比与传统生理生化鉴定，分子型鉴定具有许多优势：

①可检测范围更广：即使无法通过培养得到纯菌落，只要能够提取得到微量的DNA就可以通过分子生物学的方法进行测序鉴定。

②鉴定结果重复性更好：DNA序列在通常情况下都是稳定的，不会应为菌群的生长周期而发生变化。因此，在菌群生长的任何时期进行基因型鉴定，得到的结果都是一致的。（即便是死菌，只要DNA未被降解也可以进行鉴定）。

③鉴定结果一致性高：序列比对通过特定的算法由计算机自动分析生成，不向传统生化鉴定方法一样需要人工对结果进行判读。

④鉴定结果数字化，方便存储和溯源调查：基因型鉴定得到的是碱基排布序列信息，在进行溯源调查或者室间比对时，可以通过直接比对序列相似度来判断两个样本是否为同一个菌种，并不依赖其在物种鉴定时所得到的种属信息。

⑤鉴定数据库鉴定范围更广：与传统生化方法相比，细菌基因型鉴定的数据库所收录的菌种数量更多（为生化鉴定数据库的5~10倍）。同时，随着研究的进一步深入，每年都有大量新的菌种基因信息被收录进数据库中。