真菌ITS鉴定

本文关键词：真菌鉴定、菌种鉴定、真菌基因鉴定、分子鉴定、真菌ITS鉴定、微生物检测、微生物鉴定

技术介绍

ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。ITS：内转录间隔区，是位于真菌核糖体RNA（rRNA）基因转录区或对应多顺反子rRNA前体中大、小亚基rRNA之间的核酸序列。用于真菌鉴定的ITS序列通常包括ITS1、5.8S和ITS2。真菌ITS 区域长度一般在500～750bp(碱基对)。

基于ITS基因测序的优点

为了解决D2基因真菌鉴定的局限性，相关研究发现核糖体操纵子中的ITS序列可更好的被应用于真菌的系统鉴定。在真菌的核糖体操纵子中有两个ITS区域。ITS1位于18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。整个rRNA操纵子一起转录，但转录后的rRNA，两个不具备功能的ITS被剪切掉。ITS序列作为一个间隔序列十分重要，但同时它又不具备功能，因此，它的突变速度会大于5.8S、18S和28S基因。这少量的突变提升，使得ITS的序列相比D2具备更好的多态性。因此，将ITS1-5.8S-ITS2整个测序有助于真菌分类。

传统的真菌鉴定和其限制因素

真菌是一类特殊的真核微生物，大约有十万余种。在洁净室造成污染的真菌主要为霉菌和酵母两种。鉴定方法上，基于表型鉴定方法由于相对较低的成本，被大量实验室广泛地使用，但这往往需要有经验的技术人员才能胜任，比如对培养基、培养条件的选择等；此外表型鉴定还受到参考数据库的大小和类型的限制，这些数据库多是面向临床诊断而不是工业应用，所以基于这类数据库的鉴定结果往往存在一定的偏差。准确的鉴定结果对发现污染菌超标和溯源十分重要，错误的鉴定结果往往导致后续的消杀治理等工作并没有效果。近年来，分子生物学的发展，为真菌的准确鉴定提供了新的可靠的技术手段和鉴定渠道。

相比基于表型信息的鉴定结果，基因测序提供的数据具有更准确，重现性好的特点，这已被业界普遍认可和接受。美国食品和药物管理局（FDA）在2004年更新的指导文件中引入了遗传方法，在美国食品药品管理局“FDA无菌生产指南（FDA Guidance for Industry. Sterile Drug Products Produced by AsepticProcessing – Current Good Manufacturing Practice）”文件中，FDA强调在进行环境微生物监测方面，相比传统的生化和表型的技术，基因型的鉴定方法已经被证实具有更准确和更精确的优势，特别是在无菌测试、模拟灌装污染等的调查中具有重要的价值。cFDA于2015年12月1日开始实施的2015版药典中，在“9204 微生物鉴定指导原则”、“9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则”中也建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定，微生物菌群信息有助于预期常见菌群，同时也强化了通过测序进行基因型鉴定的概念。

相比与传统生理生化鉴定，分子型鉴定具有许多优势：

①可检测范围更广：即使无法通过培养得到纯菌落，只要能够提取得到微量的DNA就可以通过分子生物学的方法进行测序鉴定。

②鉴定结果重复性更好：DNA序列在通常情况下都是稳定的，不会应为菌群的生长周期而发生变化。因此，在菌群生长的任何时期进行基因型鉴定，得到的结果都是一致的。（即便是死菌，只要DNA未被降解也可以进行鉴定）。

③鉴定结果一致性高：序列比对通过特定的算法由计算机自动分析生成，不向传统生化鉴定方法一样需要人工对结果进行判读。

④鉴定结果数字化，方便存储和溯源调查：基因型鉴定得到的是碱基排布序列信息，在进行溯源调查或者室间比对时，可以通过直接比对序列相似度来判断两个样本是否为同一个菌种，并不依赖其在物种鉴定时所得到的种属信息。

⑤鉴定数据库鉴定范围更广：与传统生化方法相比，细菌基因型鉴定的数据库所收录的菌种数量更多（为生化鉴定数据库的5~10倍）。同时，随着研究的进一步深入，每年都有大量新的菌种基因信息被收录进数据库中。

细菌全基因组鉴定

细菌全基因组鉴定，是指通过基因组测序和组装获得细菌全基因组序列进行细菌鉴定的方法。相较于16S rRNA基因鉴定，全基因组测序组装可对细菌基因组结构和功能进行研究，获得更多遗传信息，可以实现菌株水平的分型、对特定功能基因的进一步分析比较等。

在《中国药典》2020版三部“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制中”对于细菌性疫苗/病毒性疫苗和重组工程菌/毒种均有提到因进行全基因序列测定，已确认其安全性、稳定性等。

基因组草图：

草图采用小片段建库，深度测序和初步的基因组组装策略，能够得到待测样本的基因组信息，性价比高，能满足细菌基因组研究基本需求。

基因组完成图：

细菌完成图综合利用二代三代测序技术，根据菌株具体信息进行基因组测序组装，最终可以得到无gap的完整基因组序列。

差异菌株分析：

通过CARD，VFDB数据库比对分析，多位点序列分型MLST和核心基因组多位点序列分型cgMLST， 单核苷酸位点SNP分析，泛基因分析，系统进化分析等将菌株间的差异进行展示。

检测流程：

目的基因及质粒测序

《中国药典》2020年版3部“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”中提到对重组工程菌生产用菌种主种子批检定，一般应包括目的基因序列测定、外源基因与宿主基因的检定、外源基因整合于宿主染色体的检定等项目。重组工程毒种生产用主种子批检定，一般应通过测序技术，对基因工程菌中目的基因/质粒进行序列测定，能够明晰目的基因/质粒序列中的碱基组成，确定目的基因序列的插入位置，明确目的基因序列是否存在突变。

目的基因的全序列测序一般采用Sanger测序（一代测序），质粒测序则既采用一代测序，也可通过高通量测序分析技术实现，为药品领域生产用菌种的质量管理提供解决方案。

生产用菌毒种的检定

EMPYUN® GEBID 生产用菌种主种子批检定服务（细菌性疫苗、重组工程菌）主要为相关菌株提供包括表型特征、全基因组序列测定、目的基因测序、外源基因与宿主基因检定、质粒酶切图谱等检定项目。

《中国药典》2020年版3部“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”：

1、细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定：生产用菌种的种、属、型分类鉴定，包括形态、生长代谢特性和遗传特性。活菌制剂还应进行抗生素敏感性测定。细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定一般应包括培养特性、革兰氏等染色方法镜检、生化反应、血清学试验、毒力试验、免疫效价测定、培养物纯度、活菌数测定、16S rRNA基因序列测定、全基因序列测定等项目。

2、病毒性疫苗生产用毒种主种子批检定：一般应包括鉴别试验、病毒滴度、外源污染因子检查（无菌、分枝杆菌、支原体、外源病毒因子检查），主要功能基因和遗传标志物测定，免疫原性检查，动物神经毒力试验， 动物组织致病力或感染试验，全基因序列测定等项目。

3、重组工程菌生产用菌种主种子批检定：一般应包括培养特性、菌落形态大小、革兰氏等染色方法镜检、对抗生素的抗性、生化反应、培养物纯度、全基因序列测定、目的产物表达量、透射电镜检查、目的基因序列测定、外源基因与宿主基因的检定、外源基因整合于宿主染色体的检定、外源基因拷贝数检定、整合基因稳定性试验、目标产物的鉴别、质粒的酶切图谱等项目。

4、重组工程毒种生产用主种子批检定：一般应包括全基因序列测定， 目的基因序列测定，病毒滴度检测，目的蛋白表达量，细菌、真菌、分枝杆菌、支原体、内外源病毒因子检查等项目。

微生物传统表型鉴定方法

本文关键词：细菌鉴定、菌种鉴定、微生物检测、微生物鉴定、API试纸条、VITEK鉴定、biolog鉴定、生理生化、表型鉴定、血清学鉴定

微生物传统表型鉴定方法主要根据微生物的形态特征和理化特性来区分不同微生物间的差异。形态特征包括：显微形态和培养特征；理化特性包括：营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。

微生物传统表型鉴定是一种经典的微生物分类鉴定方法，以微生物的形态和习性等表型为主要指标，通过比较微生物的菌落形态、理化特征和特征化学成分与典型微生物的差异进行鉴别。（表1）

目前微生物传统鉴定方法的有：

API 微生物鉴定系统以微生物生化理论为基础,根据微生物对所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，包括分析各种生理条件（温度、pH、氧气、渗透压）、生化指标（唯一碳氮源、抗生素、酶、盐碱性）代谢反应析，并将结果转化成软件可以识别的数据，进行聚类分析，与已知的参比菌株数据库进行比较，最终对未知菌进行鉴定的一种技术。

VITEK对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础，不同种类的VITEK试卡（检测卡）含有多种的生化反应孔。将待检菌的纯菌落制成符合一定浊度要求的菌悬液，经充填机将菌悬液注入试卡内，封口后放入读数器/恒温培养箱，根据试卡各生化反应孔中的生长变化情况，由读数器按光学扫描原理，定时测定各生化介质中指示剂的显色(或浊度反应，然后把读出信息输入电脑储存并进行分析，再和预定的阈值进行比较，判定反应，再通过数值编码技术与数据库中反应文件进行比较，最后得到鉴定报告。

BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。

采用Sherlock全自动细菌鉴定系统，通过对不同菌株的短链脂肪酸的种类和含量，绘制成脂肪酸图谱进行分析，并与标准数据库进行比对，来鉴定细菌及酵母。

微生物传统表型鉴定已广泛应用于药品微生物实验室。根据微生物表型鉴定所提供的信息可以判断药品中污染的微生物种类，也可掌握环境微生物菌群的变化，并进行产品的风险评估。在许多质量控制调查中，单独的表型鉴定结果就能给出充足的信息帮助调查人员进行深入调查，并按需要制定适宜的纠正措施。但是，微生物传统表型鉴定仍有很多不足，如：

1、微生物细胞的大小和形态、芽孢、细胞成分、表面抗原、生化反应和对抗菌剂的敏感性等表型的表达，除受其遗传基因的控制外，还与微生物的分离环境、培养基和生长条件等因素有关。

2、微生物表型鉴定通常需要先取得大量的纯培养物，而微生物的恢复、增殖和鉴定易受培养时间影响，事实上许多环境微生物在普通的微生物增殖培养基中是无法培养得到的。

3、一些从初始培养物中刚分离出的受损微生物还可能不能完整的表达其表型属性。因此，在表型鉴定时应注意采用的培养基、培养时间和传代次数对鉴定结果的影响。

4、传统表型鉴定的结果需要鉴定人员进行判断，易受到经验等主观因素的影响。

5、微生物在不同生长时期可能会表现出截然不然的表型特征，因此，即便是同一种菌如果在不同生长时期进行鉴定，鉴定结果也可能不同。

6、通过表型鉴定进行溯源调查时，溯源调查的准确性完全依赖于表型鉴定所得到的种属信息，一旦无法得到准确的种属信息，溯源就无法进行下去。