即细菌16S rRNA基因，是编码细菌核糖体小亚基的基因，作为细菌鉴定的基因标志物使用了几十年，它的优势在于所有的细菌都具有：长度适中，进化上具有良好的时钟性质，结构与功能上具有高度的保守性，能很好体现不同菌属之间的差异，又能轻松利用测序技术得到其序列，故被细菌学家和分类学家普遍认可，素有“细菌化石”之称。

一般情况下，细菌分类学中普遍的共识是

序列相似度在97%以上的，可以认为目标菌种与参考序列所属的菌种为同一个属；

序列相似度在99%以上的，可以认为目标菌种与数据库序列所属的菌种为同一个种。

细菌的16S基因在微生物种属分类鉴定上具有重要的参考价值，被公认是一把好的谱系分析“分子尺”，目前公认比较全面的细菌分类手册《伯杰氏系统细菌学手册》（第二版）就是根据16S基因序列分析，按照系统发育为框架编写的。

对于制药企业来讲，细菌鉴定是药品微生物检验中的重要环节，药典通用技术要求相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确规定：

如非无菌产品微生物限度检查，控制菌检查法(通则 1106)中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定;

对无菌检查法(通则 1101)的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试，药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则(通则 9205)中建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。

此外，在药品生产中，有时亦需对药物原料辅料、制药用水、中间产品、终产品和环境等中检出的微生物进行适当水平的鉴定。

（图1）

16S基因全长约1500bp，包含9个可变区和10个恒定区（图1）。目前中国药典中使用V1-V3进行细菌16s鉴定，而在实际应用中，往往会有一部分物种因测序长度太短而导致分辨率不足，主要表现为并列结果（无法与其他近缘物种区分）或结果偏差（与全长结果不一致），需要将16S序列测到1000bp或者全长来获得更好的分辨率 (图2是基于现有数据库中存在的16S序列绘制系统发育树，每个分支的颜色反映了不同可变区域不能被识别到物种水平的序列的比例)。

有一些情况甚至需要利用别的管家基因辅助进行鉴定区分，常用的管家基因包括rpoB、recA、gyrA等。今年刚发布的1021细菌DNA特征序列鉴定法草案公示稿中也明确提出，对于利用 16S基因序列无法准确区分鉴定的一些近源菌种，也可结合其他经过验证的基因特征序列或全基因组序列进行分子生物学鉴定。

（图2）

由于其他管家基因还没有得到如此深入的研究，16S仍然是细菌鉴定和遗传进化研究中最广泛使用的稳定靶标。随着高通量测序技术的发现越来越多的细菌存在多条16S基因序列，后续的细菌16S鉴定可以考虑16S基因拷贝之间的基因组内变异，以期利用全长16S基因组内拷贝变异实现菌株水平的分辨，当然随着高通量测序技术的发展，全基因组核酸测序已经可以得到菌株核酸水平的全部遗传信息，通过核酸序列的比对分析，进行菌株的鉴定、分型与溯源，结果更加客观、准确，是溯源分析技术发展的主要趋势。